Transplantation transnasale de cellules microgliales humaines dérivées de cellules souches pluripotentes induites dans le cerveau de souris

Résumé

Source : Parajuli, B., et.al. Transplantation de microglie dérivée de cellules souches pluripotentes humaines induites dans le cerveau de souris immunocompétentes par voie transnasale non invasive. J. Vis. Exp. (2022).

Cette vidéo démontre la transplantation transnasale de cellules microgliales humaines dérivées de cellules souches pluripotentes induites (iPSMG) dans le cerveau d’une souris. L’hyaluronidase est appliquée sur les narines d’une souris appauvrie en microglies pour améliorer la perméabilité. La suspension d’iPSMG est administrée par voie intranasale et la souris est laissée se rétablir. Un milieu riche en facteurs de croissance est administré régulièrement pour favoriser la survie de l’iPSMG dans le tissu cérébral.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

1. Préparez le

1. milieu cellulaire en ajoutant 10 % de sérum de veau fœtal et 0,1 % de pénicilline/streptomycine dans le milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM).
2. Préparez le milieu de transplantation en ajoutant le facteur de stimulation des colonies humaines 1 ou hCSF1 (250 ng/mL) et le facteur de croissance transformant humain bêta 1 ou hTGF-β1 (100 ng/mL) au milieu cellulaire.
3. Préparez le mélange d’anesthésie pour injection intrapéritonéale en mélangeant 0,45 mL de chlorhydrate de médétomidine, 1,2 mL de midazolam et 1,5 mL de tartrate de butorphanol dans 11,8 mL de solution saline normale.

2. Préparation de cellules microgliales humaines dérivées de cellules souches pluripotentes induites (iPSMG)

REMARQUE : L’iPSMG (Table of Materials) congelée a été conservée à -80 °C jusqu’à son utilisation.

1. Décongelez rapidement les cellules congelées dans un bain-marie à 37 °C. Faites tourner les échantillons jusqu’à ce que toute la glace visible ait fondu.
2. Ajouter la microglie humaine dérivée de cellules souches pluripotentes induites (iPSMG) décongelées dans le milieu de culture chauffé à 37 °C. Ajouter 1 mL de cellules décongelées contenant du milieu (1 × 10 6 cellules) à 10 mL de milieu de culture.
3. Centrifuger les cellules à 300 x g pendant 5 min pour obtenir une pastille cellulaire.
4. Après la centrifugation, éliminer tout le surnageant sans perturber la pastille cellulaire. L’élimination complète du surnageant est souhaitable pour réduire la dilution de la concentration de cytokines dans le milieu de transplantation.
5. Ajouter le milieu de transplantation pour obtenir une concentration cellulaire de 1 x 10⁵ cellules/μL.
6. Placez l’iPSMG sur de la glace et procédez immédiatement à la transplantation.
   REMARQUE : La préparation de l’iPSMG pour la transplantation est effectuée sur un banc propre pour éviter toute contamination.

3. Préparation de la souris pour la transplantation transnasale (Tsn)

1. Nourrissez les souris mâles de type sauvage (C57BL/6J, 8 semaines) avec un régime contenant du PLX5622 pendant 7 jours.
2. À la fin du 7^ème jour, cessez le régime PLX et nourrissez les souris avec un régime normal jusqu’à la fin de l’étude.
   REMARQUE : PLX5622 régime contenant est préparé en ajoutant 1,2 g de PLX5622 dans 1 kg d’AIN-93G (Table des matériaux).

4. Transplantation transnasale de cellules

1. 24 h après l’arrêt de l’alimentation PLX, peser les souris et les anesthésier par injection intrapéritonéale du mélange d’anesthésie (0,2 mL/20 g).
2. Une fois que les souris ont été complètement anesthésiées, comme l’indique l’absence de réponse au réflexe de retrait de la pédale (pincement ferme de l’orteil), administrez 2,5 μL d’hyaluronidase dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) (100 U/mL), 1 h avant la transplantation transnasale d’iPSMG dans chaque narine à deux reprises à l’aide d’une pointe de pipette de 10 μL pour augmenter la perméabilité de la muqueuse nasale.
3. Après l’application de la hyaluronidase, placez les souris en position couchée.
4. Répétez l’étape 4.2 10 min avant la transplantation transnasale d’iPSMG.
5. Appliquez 2,5 μL de suspension cellulaire dans une narine de la souris à l’aide d’une pointe de pipette de 10 μL.
6. Placez la souris en position couchée pendant 5 minutes avant d’administrer la suspension cellulaire à l’autre narine.
7. Répétez les étapes 4.5 et 4.6 quatre fois, en appliquant un volume total de 20 μL par animal.
8. Placez la souris en position couchée sur un coussin chauffant à 37 °C jusqu’à ce qu’elle se remette de l’anesthésie.
9. 48 h après l’arrêt de l’alimentation PLX, répétez à nouveau les étapes 4.1-4.7 sur les mêmes souris.
   REMARQUE : Il convient de noter que les cellules iPSMG sont placées sur de la glace pendant la transplantation.

5. Application de cytokines

1. Anesthésier les souris par une injection intrapéritonéale d’un mélange d’anesthésie (0,2 mL/20 g).
2. Appliquez 2,5 μL du milieu de transplantation dans une narine de la souris à l’aide d’une pointe de pipette de 10 μL.
3. Placez la souris en position couchée pendant 5 minutes avant d’administrer le milieu de transplantation à l’autre narine.
4. Répéter les étapes 5.2 et 5.3 quatre fois, en appliquant un volume total de 20 μL par animal.
   REMARQUE : Il convient de noter que l’administration transnasale d’un milieu de transplantation (cytokines humaines) est nécessaire toutes les 12 h pour assurer la viabilité de l’iPSMG transplanté jusqu’à la fin de l’étude.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)	Thermo Fisher Scientific	10566
AIN 93G	Oriental Yeast Co
Fetal bovine serum	GE Healthcare Life Sciences	SH30070.03
Frozen iPSMG	Shionogi & Co., Ltd		Laboratoire pour la découverte de médicaments et la recherche sur les maladies
Facteur de stimulation des colonies humaines 1 (hCSF1)	PeproTech	300-25
Hyaluronidase	Sigma-Aldrich	H-3506
Chlorhydrate de médétomidine	Meiji Seika	VETLI5
Midazolam	Astellas	18005A2
Paraformaldéhyde	Wako Pure Chemical Industries	162-16065
Pénicilline/streptomycine	Thermo Fisher Scientific	15140-122
Pipette	Eppendorf	3120000011
Pointe de pipette	Eppendorf	30076028
PLX5622	Amadis Chemical	A930097
Facteur de croissance transformant-β1 (Tgf-b1)	PeproTech	100-21